清華大學(xué)曲久輝院士團(tuán)隊(duì)Angew:物理抽提磷脂協(xié)同自由基氧化實(shí)現(xiàn)病原微生物高效滅活
成果簡(jiǎn)介
目前,世界各地醫(yī)院和社區(qū)中的各種細(xì)菌感染正構(gòu)成嚴(yán)重的公共健康和環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)。為解決這些問(wèn)題,我們研究了一種創(chuàng)新的基于納米片細(xì)菌滅活系統(tǒng)的“毒箭頭”消毒方法,利用二維MoS2的“箭頭”構(gòu)型從細(xì)胞膜中有力地提取脂質(zhì)并隨后使膜破裂。在強(qiáng)氧化劑過(guò)硫酸鹽(PMS)的存在下,MoS2的硫空位激活了穩(wěn)定的分子,進(jìn)而從邊緣位置到基底區(qū)域產(chǎn)生活性氧物種。這一過(guò)程不僅清除了部分磷脂以實(shí)現(xiàn)MoS2表面的更新,同時(shí)直接攻擊蛋白質(zhì),對(duì)受損細(xì)胞造成進(jìn)一步損傷,增強(qiáng)病原微生物的受損細(xì)胞膜的壓力。少量納米片材料存在下,可實(shí)現(xiàn)30s內(nèi)對(duì)天然水進(jìn)行消毒(按細(xì)菌總數(shù)計(jì)算,滅活率為99.93%)。
引言
目前,已出現(xiàn)包括非均相芬頓、光電催化在內(nèi)的多種高級(jí)氧化技術(shù)應(yīng)用于水中細(xì)菌的滅活。自由基攻擊細(xì)胞膜,改變其高分子結(jié)構(gòu),誘發(fā)通透性變化,造成細(xì)胞內(nèi)必要的酶外泄,細(xì)菌由于無(wú)法完成新陳代謝、有絲分裂等生命活動(dòng)而被滅活。雖然自由基能夠氧化細(xì)胞膜的各種成分,但由于細(xì)胞膜的成分組成主要是磷脂、蛋白、多糖等高分子有機(jī)物,所以氧化過(guò)程需要大量自由基,這就導(dǎo)致了以自由基為主的消毒方式的停留時(shí)間比較長(zhǎng)。作為典型的二維納米材料,MoS2顯著的細(xì)胞毒性來(lái)源于靜電效應(yīng)和硫脂之間的范德華力。由于負(fù)硫位點(diǎn)易與脂類中親水頭部結(jié)合,MoS2的納米邊緣可以切割細(xì)胞膜,促進(jìn)膜中磷脂的提取,從而導(dǎo)致膜破裂和細(xì)菌細(xì)胞死亡。然而,隨著納米片表面有效活性位的迅速被占據(jù),二維納米材料喪失對(duì)病原微生物的滅活能力。因此,對(duì)于納米材料物理殺菌過(guò)程,應(yīng)考慮如何恢復(fù)納米材料殺菌性能,使其保持持續(xù)殺菌能力。為了緩解自由基氧化的負(fù)荷,結(jié)合納米材料的物理殺菌過(guò)程,我們創(chuàng)新提出納米材料殺菌的理化協(xié)同機(jī)制:納米材料對(duì)細(xì)菌的物理?yè)p傷降低了自由基氧化的負(fù)荷,同時(shí)自由基能夠清潔納米材料表面,促使納米材料恢復(fù)物理殺菌的性能,理化過(guò)程相互促進(jìn)和補(bǔ)充,共同實(shí)現(xiàn)水中致病菌的快速滅活(圖1a)。
圖文導(dǎo)讀
初步比較了不同濃度的PMS的存在下MoS2納米片的抗菌活性(圖1b)。在無(wú)PMS存在下,由MoS2作用60min后,對(duì)大腸桿菌的殺菌效率約為~0.34(對(duì)數(shù)去除率)。此外,PMS具有化學(xué)氧化抑菌能力,在25℃下將E.coli和10mg/L的PMS溶液共同培養(yǎng)60min后,E.coli滅活率達(dá)到94%,此外,MoS2/PMS體系明顯提升了E.coli滅活效率,共同培養(yǎng)60min后,體系中E.coli的滅活率達(dá)到>99.9986%。此外,如圖1c所示,通過(guò)Alamarblue試劑盒對(duì)不同殺菌體系的新陳代謝水平評(píng)價(jià)可知,MoS2/PMS體系對(duì)E.coli的新陳代謝抑制高達(dá)97.0%,幾乎徹底殺滅所有E.coli。而物理殺菌體系對(duì)E.coli新陳代謝的抑制和MoS2濃度正相關(guān),在MoS2濃度分別為10μg/L,25μg/L和50μg/L時(shí),新陳代謝抑制分別達(dá)到11%,24%和36%,證實(shí)了物理?yè)p傷和ROS氧化之間的協(xié)同作用可能導(dǎo)致優(yōu)異的抗菌性能。
圖1. a.物理-化學(xué)協(xié)同強(qiáng)化病原微生物滅活機(jī)制圖;b-c.MoS2、PMS和MoS2/PMS系統(tǒng)的消毒性能和大腸桿菌活性比較
為了深入研究理化協(xié)同機(jī)制,我們首先制備了不同含硫空位的MoS2納米片(圖2a-b),并明確了MoS2納米片對(duì)E.coli的物理?yè)p傷過(guò)程(圖2c)。不同物理?yè)p傷階段的E.coli的切片透射電鏡圖和掃描電鏡圖如圖2c所示。第一階段是鮮活的E.coli的切片,其邊緣清晰,厚度約10nm,復(fù)合磷脂雙分子層的理論厚度;細(xì)胞質(zhì)飽滿,可明顯看到膠質(zhì)填充滿的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。隨著MoS2和E.coli接觸時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞膜的形態(tài)達(dá)到第二階段,大量MoS2接觸E.coli細(xì)胞膜,細(xì)胞膜邊緣顏色變淺,部分區(qū)域的細(xì)胞膜“攤開(kāi)”成一片。這一步主要發(fā)生了磷脂的抽提,MoS2在接觸細(xì)胞膜后,通過(guò)靜電吸引和分子間作用力將磷脂分子從細(xì)胞膜中抽提至MoS2表面,隨著抽提的進(jìn)行,細(xì)胞膜逐漸變薄,有些區(qū)域的磷脂和MoS2混在一起。細(xì)胞膜形態(tài)在長(zhǎng)時(shí)間磷脂抽提后達(dá)到第三階段,大規(guī)模長(zhǎng)時(shí)間的磷脂抽提已經(jīng)扭曲了細(xì)胞膜的原始外形,抑制了E.coli有絲分裂增殖,此外,可明顯看出細(xì)胞質(zhì)流失,E.coli由于缺少新陳代謝酶而最終滅活。
圖2. a.二維MoS2納米片的HAADF-STEM圖像;b.原子水平的MoS2結(jié)構(gòu)的偽色彩圖像;c.MoS2條件下活大腸桿菌和死大腸桿菌的形態(tài);d. 暴露于不同濃度MoS2懸浮液的大腸桿菌細(xì)胞釋放的LDH含量;e.MoS2納米片在300 K下從POPE脂質(zhì)膜中提取脂質(zhì)的過(guò)程;f.MoS2納米片底部與脂質(zhì)中的磷原子在300 K之間的z位置信息;g.細(xì)胞膜和MoS2納米片的相互作用能隨時(shí)間的演化
隨后,通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬能夠更細(xì)致深入的揭示物理抽提過(guò)程,在建模之前,通過(guò)HPLC-HRMS準(zhǔn)確測(cè)定了E.coli細(xì)胞膜的磷脂組成及比例。如圖2e所示,磷脂組學(xué)揭示了E.coli細(xì)胞膜中的主要成分,磷脂酰乙醇胺(PE)占總磷脂的比例為83.7%,磷脂酰甘油(PG)比例為14.2%,心磷脂(CL)比例為2.12%,其余為極少量的溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)。而在PE中,以sn1:sn2=16:0/18:1的1-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)為主,如圖2f所示,POPE占全體PE的比例高達(dá)21%。高分辨質(zhì)譜結(jié)果為MD模擬建模提供了理論依據(jù),在MD建模時(shí),磷脂分子層的模型被建立為雙層POPE。無(wú)缺陷的MoS2入侵細(xì)胞膜的分子動(dòng)力學(xué)模擬如圖2g所示,經(jīng)過(guò)約100ns的自由運(yùn)動(dòng)到達(dá)POPE膜表面,其邊緣首先和POPE分子接觸,促使POPE膜發(fā)生微弱的形變,隨著接觸時(shí)間的延長(zhǎng),在靜電吸引和分子間作用力的趨勢(shì)下,MoS2納米片不斷變換位置,開(kāi)始從磷脂層中抽離POPE分子。幾百納秒后,細(xì)胞膜上的磷脂疏水尾巴很容易鋪展到整個(gè)MoS2上,導(dǎo)致在TEM圖像中出現(xiàn)大量的膜皺紋。
圖3 a. MoS2/PMS系統(tǒng)中ROS生成的熒光成像;b.利用EPR光譜測(cè)定ROS;c.LSCM明長(zhǎng)模式觀察PMS激活過(guò)程中MoS2的形態(tài)變化;d.離心獲得上清液或消化上清液中磷酸鹽的濃度;e.MoS2/PMS系統(tǒng)中死大腸桿菌的形態(tài)
隨著MoS2表面被磷脂分子完全覆蓋,納米片逐漸失去了對(duì)大腸桿菌造成物理?yè)p傷的能力。結(jié)合MoS2較強(qiáng)的活化PMS產(chǎn)自由基反應(yīng)過(guò)程,我們提出以自由基為活性中間體去除MoS2納米片表面負(fù)載的磷脂,以此加速病原微生物細(xì)胞凋亡。首先,采用香豆素作為探針檢測(cè)PMS激活產(chǎn)生的ROS(圖3a),發(fā)現(xiàn)PMS的加入可以使體系的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng),證實(shí)了有效的PMS激活位點(diǎn)發(fā)生在基底和邊緣處。隨后,自旋捕捉電子順磁共振譜的證實(shí)了MoS2/PMS體系中ROS的有效產(chǎn)生(圖3b-c)。為了深入了解自由基氧化的作用,我們進(jìn)一步研究了磷形態(tài)在滅菌過(guò)程中的演變過(guò)程(圖3d)。與單一物理抽提或化學(xué)損傷相比,協(xié)同滅菌過(guò)程中磷從磷脂向水溶液的轉(zhuǎn)移過(guò)程明顯增強(qiáng)?;诖?,我們提出了物理-化學(xué)協(xié)同的病原微生物滅活新機(jī)制:物理?yè)p傷抽提磷脂并減薄細(xì)胞膜,降低ROS氧化負(fù)荷;化學(xué)氧化除自身氧化細(xì)菌的細(xì)胞膜磷脂外,“清潔”已被MoS2抽提的磷脂分子,恢復(fù)MoS2抽提能力。
圖4a. 垂直生長(zhǎng)于碳布上MoS2的FE-SEM圖像;b.MoS2尖銳邊緣的HAADF-STEM圖像;c.僅在PMS,SMCS/ PMS和SMCS/ PMS / TBA系統(tǒng)中產(chǎn)生ROS的EPR光譜;d.自制過(guò)濾器支架的示意圖;e.SMCS的殺菌性能;f.將SMCS/ PMS系統(tǒng)與可比的消毒系統(tǒng)的殺菌性能的比較;g.活細(xì)菌和死細(xì)菌細(xì)胞的暗場(chǎng)熒光顯微鏡檢查
隨后,我們?cè)O(shè)計(jì)并制作了垂直生長(zhǎng)于碳布的MoS2陣列(SMCS)。垂直生長(zhǎng)的MoS2裸露了其鋒利邊緣,不僅可強(qiáng)化對(duì)細(xì)菌的物理?yè)p傷(圖4a-b),還能保障ROS的穩(wěn)定輸出(圖4c)。在中性條件下,PMS投加量高于100mg/L時(shí),對(duì)細(xì)菌菌落數(shù)低于106CFU/mL的廢水具有較好的消毒能力,可在不到1min內(nèi)高效殺菌,其動(dòng)力學(xué)高于以光電為主的各種消毒工藝。以此為核心組件,我們隨后組建了針對(duì)天然水體消毒的反應(yīng)器(圖4d)。該處河水的總菌群數(shù)約為3×105CFU/mL,在[PMS]=100mg/L,河水總菌群去除率達(dá)99.94%。
小結(jié)
本研究通過(guò)一種新的物理化學(xué)協(xié)同機(jī)制展示了MoS2納米片對(duì)微生物的快速滅活。主要結(jié)論如下:
?。?)在PMS分子(10mg/L)存在下,帶有硫空位的MoS2納米片(10mg/ L)脫落表現(xiàn)出對(duì)大腸桿菌(107CFU/mL)約99.999%抗菌性能。
?。?)2DMoS2納米片中的非硫空位區(qū)(SVs-freearea)通過(guò)脂質(zhì)提取破壞了大腸桿菌的膜,起到了“刀片”的作用。同時(shí),MoS2上的硫空位區(qū)在PMS的存在下產(chǎn)生ROS,攻擊損壞的脂膜,并清除不含硫空位的MoS2區(qū)域中負(fù)載的脂質(zhì)分子,從而強(qiáng)化殺菌性能。MoS2中位點(diǎn)的這種“刷新”機(jī)制確保了對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用的連續(xù)性,因此協(xié)同提取和氧化進(jìn)一步放大了細(xì)胞膜破壞壓力,并導(dǎo)致各種細(xì)菌的高致死率。
(3)采用該協(xié)同提取和氧化的消毒策略,可在超短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)天然水的消毒,總細(xì)菌滅活率達(dá)99.94%。
主要作者介紹
陳瑀,博士畢業(yè)于中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,現(xiàn)任清華大學(xué)水質(zhì)與水生態(tài)研究中心博士后 (導(dǎo)師:曲久輝院士),研究方向?yàn)楦呒?jí)氧化水處理技術(shù)與原理。迄今,以第一作者身份在Angew. Chem.-Int. Edit.,ACS appl. Mater. Inter.等國(guó)際期刊發(fā)表SCI 3篇。
張弓,博士畢業(yè)于中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院助理研究員。主要研究領(lǐng)域:(1)電化學(xué)水處理新技術(shù)與原理,(2)電化學(xué)污染物降解與同步產(chǎn)能。迄今,在Energy Environ. Sci.,J. Am. Chem. Soc.,Angew. Chem. Int. Edit.,Environ. Sci. Technol.等環(huán)境、化學(xué)權(quán)威期刊發(fā)表論文60余篇,SCI引用總計(jì)2000余次(H因子21)。獲授權(quán)中國(guó)發(fā)明專利8項(xiàng),國(guó)際發(fā)明專利1項(xiàng);曾獲中國(guó)科學(xué)院院長(zhǎng)特別獎(jiǎng),入選中國(guó)科協(xié)“青年人才托舉工程”。
曲久輝,環(huán)境工程專家,中國(guó)工程院院士、發(fā)展中國(guó)家科學(xué)院院士、美國(guó)國(guó)家工程院外籍院士,清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院特聘教授,中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心研究員。主要從事水質(zhì)科學(xué)與工程技術(shù)研究,重點(diǎn)關(guān)注飲用水水質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)控制、受污染水體生態(tài)修復(fù)等方面的理論探索、技術(shù)創(chuàng)新和工程應(yīng)用。已在國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊發(fā)表研究論文400余篇,其中SCI論文300余篇,獲授權(quán)中國(guó)、美國(guó)、歐洲等中國(guó)和國(guó)際發(fā)明專利80余項(xiàng),2014年當(dāng)選國(guó)際水協(xié)(IWA)Distinguished Fellow。曾兩次獲得國(guó)家科學(xué)技術(shù)進(jìn)步二等獎(jiǎng)及國(guó)家技術(shù)發(fā)明二等獎(jiǎng),2009年獲得何梁何利科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng),2010年分別獲得全球和東亞地區(qū)IWA創(chuàng)新項(xiàng)目獎(jiǎng)等。
編輯:王媛媛
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