廢水處理污泥中鄰苯二甲酸酯降解菌的多樣性

　　隨著塑化劑鄰苯二甲酸酯(PAEs)在日用品、建筑材料、醫(yī)藥、化妝品等生產(chǎn)行業(yè)的廣泛應(yīng)用，其在環(huán)境中的殘留、分布及對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的危害被日益關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計(jì)，PAEs在全球的年消費(fèi)量高達(dá)680萬t，由于PAEs與化合物的結(jié)合方式為物理結(jié)合，導(dǎo)致其較易釋放進(jìn)入環(huán)境，該釋放過程可發(fā)生于塑料產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用和丟棄等過程中。目前，在土壤、河水、海水、沉積物和生物群中均發(fā)現(xiàn)PAEs的存在，其在環(huán)境中長期賦存會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生毒害效應(yīng)。PAEs中應(yīng)用較廣泛的為鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)，由于其致癌性、致畸性和致突變性，DBP和DEHP已被美國環(huán)境保護(hù)署列為優(yōu)先控制污染物。

　　土壤、河水、海水甚至飲用水源中的PAEs污染問題和污水的處理、排放密切相關(guān)。目前，中國污水排放標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定了常規(guī)生化指標(biāo)和重金屬含量，但PAEs等有機(jī)污染物不在其列。因此，即使污水達(dá)標(biāo)排放，PAEs仍會(huì)隨污水進(jìn)入水環(huán)境系統(tǒng)，并對(duì)周圍土壤造成污染。

　　在中國，除農(nóng)用大棚和塑料薄膜的使用可直接導(dǎo)致PAEs污染土壤外，大部分含有PAEs的塑料制品廢棄物多通過垃圾堆放、填埋和后期污水處理進(jìn)入環(huán)境。生活、醫(yī)療和工業(yè)垃圾經(jīng)過長期堆放后，PAEs可從塑料制品中釋放，加上雨水的沖刷進(jìn)入垃圾滲濾液。包含垃圾滲濾液在內(nèi)的多種污廢水是PAEs的主要匯集場所，因此只有在污水處理環(huán)節(jié)中有效去除PAEs，才能避免污水排放后PAEs對(duì)周邊環(huán)境的二次污染。污水處理中的生物降解是去除各類有機(jī)污染物的關(guān)鍵因素。目前，關(guān)于污水處理系統(tǒng)中PAEs降解菌的多樣性和PAEs對(duì)污水處理系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響鮮有報(bào)道。本研究系統(tǒng)探究了常規(guī)廢水處理污泥對(duì)典型PAEs的微生物群落響應(yīng)特征和污泥中PAEs降解菌的多樣性，為PAEs降解菌的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

　　一、材料和方法

　　1.1 污泥取樣

　　廢水處理污泥取自浙江省紹興市某污水處理廠的好氧池，該廠長期處理化工和印染廢水。新鮮污泥樣經(jīng)沉淀和離心去除水分后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2 主要培養(yǎng)基和試劑

　　基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基:1.00g/LKH2PO4，7.04g/LNa2HPO4?12H2O，0.10g/LMgCl2?6H2O，1mL微量元素母液，pH7.2。

　　微量元素母液:2.1385g/LFeSO4?7H2O，0.1g/LZnSO4?7H2O，0.03g/LMnCl2?4H2O，0.3g/LH3BO4，0.2868g/LCoCl2?6H2O，0.02g/LNiCl2?6H2O，0.03g/LNa2MoO4?2H2O，pH4.0。

　　DBP、DEHP均為色譜級(jí)試劑，其他試劑均為分析純試劑。

　　1.3 PAEs降解菌富集培養(yǎng)

　　針對(duì)DBP和DEHP分別進(jìn)行富集培養(yǎng)，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置：取5g廢水處理污泥置于200mL基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，添加100mg/LDBP或DEHP作為碳源，置于30℃、200r/min搖床培養(yǎng)5d，轉(zhuǎn)接至含有400mg/LDBP或DEHP的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5d，再連續(xù)轉(zhuǎn)接兩輪(DBP或DEHP質(zhì)量濃度梯度為700、1000mg/L)。

　　1.4 DNA提取和序列擴(kuò)增

　　采用十六烷基三甲基溴化銨法對(duì)樣本的基因組DNA分別進(jìn)行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，樣品DNA稀釋至1ng/μL。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，New England BiGolabs公司的Phusion HighGFidelity PCR MasterMix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性，PCR擴(kuò)增引物序列及對(duì)應(yīng)區(qū)域見表1。

　　1.5 Hiseq測序和數(shù)據(jù)處理

　　使用Thermofisher公司的IonPlusFragmentLibraryKit48rxns試劑盒構(gòu)建文庫，經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后，使用IonS5TMXL上機(jī)測序，測序數(shù)據(jù)經(jīng)過Cutadapt(V1.9.1)進(jìn)行低質(zhì)量部分剪切，再截去Barcode和引物序列后，初步得到原始數(shù)據(jù)，去除原始序列中的嵌合體序列后，得到最終有效數(shù)據(jù)。

　　1.6 數(shù)據(jù)分析

　　1.6.1 可操作分類單元(OTUs)聚類和物種注釋

　　利用Uparse軟件(Uparsev7.0.1001/)對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，具有97%及以上一致性的序列歸為一個(gè)OTUs，用Mothur方法與SILVA的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋，獲得分類學(xué)信息并分別在界、門、綱、目、科、屬、種水平統(tǒng)計(jì)群落組成。

　　1.6.2 組間群落相似性分析

　　基于測序數(shù)據(jù)和OTUs聚類分析結(jié)果，使用Qiime軟件計(jì)算Unifrac距離，進(jìn)行非加權(quán)組平均法樣品聚類分析。使用R軟件的ade4包和ggplot2軟件包進(jìn)行主成分分析(PCA)，以反映組間群落相似性，并分別進(jìn)行參數(shù)和非參數(shù)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)方法選用Tukey和wilcox檢驗(yàn)。

　　1.6.3 菌群豐度和系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析

　　先使用Qiime軟件(Version1.9.1)計(jì)算菌群豐度指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)。再使用R軟件進(jìn)行菌群豐度和系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析，并分別進(jìn)行參數(shù)和非參數(shù)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)方法選用Tukey和wilcox檢驗(yàn)。

　　二、結(jié)果與討論

　　2.1 DBP和DEHP降解效率

　　實(shí)驗(yàn)證明，4輪富集培養(yǎng)后得到的富集菌液對(duì)DBP和DEHP的降解效果較佳。富集菌液對(duì)DBP和DEHP的降解效率見圖1。當(dāng)DBP和DEHP為1000mg/L時(shí)，其在培養(yǎng)第6天的降解率分別達(dá)到57.1%和36.0%，經(jīng)過10d培養(yǎng)后，富集菌液對(duì)DBP、DEHP的降解率分別可達(dá)99.9%和83.6%。DEHP的降解速率低于DBP，與文獻(xiàn)一致，而原因是DEHP含有比DBP更復(fù)雜的支鏈結(jié)構(gòu)。

　　據(jù)報(bào)道，DBP和DEHP的降解均從酯水解開始，形成中間產(chǎn)物單酯(鄰苯二甲酸丁酯或鄰苯二甲酸乙酯)和相應(yīng)的醇，單酯進(jìn)一步被降解成為鄰苯二甲酸。由于DEHP兩個(gè)酯鏈上各多出一個(gè)支鏈，導(dǎo)致其被降解為單酯的難度增強(qiáng)，是其降解速率比DBP慢的主要原因。

　　2.2 污泥菌群豐度及組間群落相似性分析

　　分別取原廢水處理污泥(簡稱RS組)和DBP、DEHP降解菌富集培養(yǎng)后污泥(分別簡稱DBP、DEHP組)進(jìn)行Hiseq測序。OTUs聚類分析發(fā)現(xiàn)，DBP、DEHP組中OTUs數(shù)量顯著低于RS組，DBP、DEHP和RS組的OTUs數(shù)量分別為226、273和848，3個(gè)樣品組共有OTUs數(shù)量為205。DBP、DEHP組中分別有90.7%、75.1%的OTUs與RS組中僅24.2%的OTUs重疊。該結(jié)果進(jìn)一步表明，富集培養(yǎng)過程中，DBP和DEHP的添加使廢水處理污泥中的微生物多樣性顯著降低。

　　本研究進(jìn)一步對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行了物種注釋和組間群落相似性分析，基于OTUs水平的PCA見圖2。樣品的群落組成越相似，則它們在PCA中的距離越接近。DBP、DEHP組物種組成相似性較高，且均與RS組差異較大。

　　2.3 污泥中優(yōu)勢菌群和PAEs降解菌的分布

　　基于菌群豐度分析結(jié)果，取相對(duì)豐度前10的優(yōu)勢門類(見表2)詳細(xì)展示不同樣品組的物種豐度。變形菌門和擬桿菌門在所有樣品組中均占優(yōu)勢，且RS組中相對(duì)豐度比DBP、DEHP組中低。在RS組中，放線菌門相對(duì)豐度也較高。通過Unifrac距離分析樣品間的相似性得知，DBP和DEHP組之間的物種豐度及優(yōu)勢門類較相似，而DBP、DEHP組均與RS組相似度較低。

　　為探討污泥中PAEs降解菌的分布，在DBP、DEHP和RS組相對(duì)豐度排名前35的屬中選取并匯總了已被報(bào)道的具有DBP或DEHP降解能力的屬，結(jié)果見表3。在DEHP組中，優(yōu)勢屬戈登氏菌屬、無色桿菌屬、紅球菌屬、根瘤菌屬和金黃桿菌屬中均被報(bào)道存在DEHP降解菌，在DBP組中，優(yōu)勢屬代爾夫特菌屬、假單胞菌屬和鞘脂菌屬中均被報(bào)道存在DBP降解菌。戈登氏菌屬、紅球菌屬和根瘤菌屬還同時(shí)被報(bào)道存在DBP降解菌，表明許多具有DEHP降解能力的微生物菌株可能同時(shí)存在DBP降解能力，其余屬不具備同時(shí)降解DBP和DEHP的能力，進(jìn)一步表明DEHP比DBP更難降解，該結(jié)果和DEHP存在更復(fù)雜的支鏈結(jié)構(gòu)相關(guān)。鑒于DEHP更難被降解，微生物如果能有效降解DEGHP，則其更容易降解結(jié)構(gòu)相似且沒有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的DBP。系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析表明，已報(bào)道的PAEs降解菌存在于多種優(yōu)勢屬中，其相互間沒有明顯進(jìn)化關(guān)系，該結(jié)論與已報(bào)道的研究結(jié)論一致，即在自然環(huán)境中PAEs降解菌存在高度的遺傳多樣性。以上結(jié)果表明，廢水處理污泥中存在多種類型PAEs降解菌。高濃度DBP和DEHP的存在促使具有DBP/DEHP降解能力的微生物群落不斷增長，進(jìn)而成為優(yōu)勢微生物，最終達(dá)到DBP和DEHP的有效降解。但低濃度PAEs的污染仍會(huì)造成各類遺傳損傷。因此，在復(fù)雜的環(huán)境中去除低濃度的PAEs仍是亟待解決的重要問題。

　　三、結(jié)論

　　(1)廢水處理污泥經(jīng)過10d培養(yǎng)后，對(duì)1000mg/L的DBP和DEHP的降解率分別可達(dá)99.9%和83.6%。DEHP的降解速率低于DBP。

　　(2)DBP和DEHP的添加顯著降低了廢水處理污泥的微生物多樣性，DBP、DEHP組物種組成相似性較高，且均與RS組差異較大。

　　(3)廢水處理污泥中存在多種類型PAEs降解菌。高濃度DBP和DEHP的存在促使具有DBP/DEHP降解能力的微生物群落不斷增長，進(jìn)而成為優(yōu)勢微生物，最終達(dá)到DBP和DEHP的有效降解。（來源：浙江科技學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院,浙江省廢棄生物質(zhì)循環(huán)利用與生態(tài)處理技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院）