抗生素選擇壓力下短程硝化反硝化工藝微生物群落特征

近年來，抗生素已廣泛用于治療人類微生物感染、促進畜禽動物生長及病害防治等方面，據(jù)調查顯示，2013年我國抗生素總產量為24.8萬噸，總使用量約為16.2萬噸，已成為世界上最大的抗生素生產國和消費國；其中48%用于人疾病治療與預防，52%用于動物。與其他環(huán)境污染物不同，多種抗生素不能被完全代謝或消除。釋放到環(huán)境中的抗生素作為一種選擇壓力，促進抗生素抗性基因（ARGs）和抗生素抗性細菌（ARBs）的出現(xiàn)和傳播，從而增加公共衛(wèi)生風險的發(fā)生概率。目前，ARGs和ARBs已經成為一個全球公共衛(wèi)生問題。

釋放到環(huán)境中的抗生素可從不同途徑進入污水處理廠，通?？蛇_ng/L-μg/L水平，眾多研究表明，廢水中抗生素的存在會顯著改變微生物群落結構和影響污染物去除效果。如在A/O-MBR工藝中，100μg/L四環(huán)素（TC）和磺胺甲惡唑（SMX）對污染物的去除無影響，但當TC和SMX濃度為1000μg/L時，該工藝的總氮去除能力下降，出水硝酸鹽濃度顯著提高，且TC和SMX暴露改變了細菌群落結構，顯著降低了微生物多樣性。在序批式反應器（SBR）中，微生物多樣性隨TC和SMX濃度的升高而降低。此外，Matos等報道稱，在序批式生物膜反應器中50μg/L的TC暴露引起細菌群落的顯著變化。類似的研究表明，50mg/L的TC引起了微生物群落結構的顯著變化，從而使TC抗性細菌，如Arthrobactersp。和Diaphorobactersp。逐漸演變?yōu)閮?yōu)勢類群。此外，Wan等在研究不同濃度磺胺嘧啶（SD）存在條件下好氧顆粒污泥微生物群落變化時發(fā)現(xiàn)，SD改變了污泥的微生物群落結構，并且不同濃度富集了相應優(yōu)勢細菌。由此可知，深入研究抗生素選擇性壓力下微生物群落結構響應情況，可為污水處理系統(tǒng)中菌群調控與抗生素的控制提供理論依據(jù)。

與傳統(tǒng)脫氮工藝相比，短程硝化反硝化工藝具有減少40%的碳源、節(jié)省25%的曝氣能耗等優(yōu)勢，已成為國內外研究熱點。然而，短程硝化反硝化易受到各種環(huán)境因子的影響導致亞硝氮難以穩(wěn)定積累，如周等通過溶解氧（DO）和pH實時控制實現(xiàn)短程硝化反硝化，但隨著曝氣時間的增加亞硝氮積累率呈下降趨勢，且活性污泥中氨氧化菌（AOB）和亞硝酸鹽氧化菌（NOB）是動態(tài)變化的。穆等通過調控pH、DO等參數(shù)促進AOB增殖，抑制NOB生長，從而實現(xiàn)短程硝化反硝化，由于參數(shù)控制對微生物群落的篩選作用，Chloroflexi、Bacteroidetes和Proteobacteria成為污泥中的優(yōu)勢菌門。由此可知，該工藝的脫氮性能主要受系統(tǒng)中微生物活性與菌群組成的驅動，作為重要的環(huán)境因子，目前關于抗生素選擇性壓力下短程硝化反硝化工藝中微生物活性與菌群如何響應還缺乏系統(tǒng)研究。基于此，本研究主要考察典型抗生素TC和SD作用下SBR系統(tǒng)的脫氮性能，分析了TC和SD暴露對活性污泥胞外聚合物（EPS）、比耗氧速率（SOUR）的影響，重點解析了系統(tǒng)中微生物群落結構的動態(tài)演替規(guī)律。本研究結果不僅有力擴充了抗生素選擇壓力下短程硝化反硝化工藝的脫氮性能和微生物生理生化動態(tài)變化情況，同時深入研究了抗生素選擇性壓力下微生物群落結構響應規(guī)律，可為短程硝化反硝化工藝的實際應用提供理論基礎。

1、材料與方法

1.1 模擬生活污水

本研究處理的污水為模擬生活污水，無機鹽培養(yǎng)基、微量元素的組成均參照本實驗室前期配方：氮源為硫酸銨，碳源為葡萄糖。由于TC和SD使用量大，在廢水中檢出率高，因此，本研究將TC和SD作為目標抗生素。SD購于阿拉丁公司（純度為98%），TC（生物技術級）購于麥克林公司，TC和SD配制成母液儲存于棕色瓶中4℃保存。

1.2 SBR反應器的設置與運行

采用實驗室規(guī)模序批式反應器（SBR，有效容積為25L）處理模擬生活污水，通過運行參數(shù)的控制啟動短程硝化反硝化，具體運行參數(shù)與進水水質設置如表1所示。反應器連續(xù)運行151d，其運行周期設置為280min：進水30min，曝氣120min，缺氧60min，曝氣30min，沉淀30min，出水10min。接種物取自某市政污水廠曝氣池處理單元的活性污泥,并在實驗室馴化一段時間，馴化的培養(yǎng)基為高氨氮培養(yǎng)基，氨氮濃度約為200mg/L，其他成分與模擬生活污水一致，馴化后污泥的平均氨氧化速率達23.7mgL-1h-1，且保持較高的亞硝氮積累率。

為了考察抗生素選擇壓力對短程硝化反硝化工藝的影響，本試驗分兩個階段運行，階段一（1-105d）：短程硝化反硝化工藝的啟動與穩(wěn)定運行。根據(jù)設置的參數(shù)運行反應器，并根據(jù)COD、NH4+-N、TN去除情況以及亞硝氮積累率判斷短程硝化反硝化的啟動與穩(wěn)定運行情況，此階段不添加抗生素。階段二（106-151d）：抗生素選擇性壓力階段，主要考察抗生素添加對短程硝化反硝化工藝性能的影響，其中TC和SD的投加濃度分別為100μg/L。

1.3 SOUR與EPS測定

SOUR作為考察微生物代謝活性的一個重要指標，從微生物呼吸速率角度反映了活性污泥生理狀態(tài)和基質代謝狀況。本研究分別于階段一（第61天、87天、105天）和階段二（第116天、126天、136天、151天）使用便攜式溶解氧探頭連續(xù)監(jiān)測DO來評估，SOUR是使用Depletion線（作DO-時間t的曲線）的斜率除以污泥濃度（MLSS）來計算，每個樣品設置3個平行。

為了考察抗生素脅迫對活性污泥EPS組成的影響,分別于階段一（第26天、87天、105天）和階段二（第116天、126天、136天、151天）采集活性污泥樣品用于EPS的測定。EPS提取采用熱提取法。EPS中主要組分多糖（PS）與蛋白（PN）的測定方法分別為BCA法與苯酚-硫酸法。

1.4 微生物群落結構分析

分別于階段一（第61天、105天）和階段二（第126天、151天）中從SBR中收集活性污泥樣品進行微生物群落分析。采集適量SBR中的泥水混合液樣品，5000r/min離心10min（4℃），棄上清液收集污泥樣品于2mL無菌無酶離心管中，放置于-80℃冰箱保存，每個樣品3個平行。各階段對應的樣品名稱分別為YR2-1、YR2-2、YR2-3、YR2-4。

1.4.1 DNA提取和PCR擴增

取污泥樣品0.25g，用E.Z.N.A.?soilDNAkit（OmegaBio-tek，Norcross，GA，U。S。）試劑盒對污泥樣品進行總DNA提取，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，使用NanoDrop2000測定DNA濃度和純度；使用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對16SrRNA基因V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增，擴增程序如下：95℃預變性3min，27個循環(huán)（95℃變性30s，55℃退火30s,72℃延伸30s），然后72℃穩(wěn)定延伸10min，最后在4℃進行保存（PCR儀：ABIGeneAmp?9700型）。

1.4.2 IlluminaMiseq測序與數(shù)據(jù)處理

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrepDNAGelExtractionKit（AxygenBiosciences，UnionCity，CA，USA）進行回收產物純化，純化后的PCR產物利用Illumina公司的MiseqPE300平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）；使用fastp軟件對原始測序序列進行質控，使用FLASH軟件進行拼接，然后使用UPARSE軟件根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體，利用RDPclassifier對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva16SrRNA數(shù)據(jù)庫（v138），最后通過查閱文獻確定系統(tǒng)中硝化和反硝化菌屬。

1.5 常規(guī)指標檢測

MLSS、NH4+-N、NO2--N、NO3--N、COD、TN均采用國家標準方法測定，pH和DO分別采用PHSJ-3F型雷磁pH計和DZB-712型雷磁便攜式溶氧儀檢測。

1.6 亞硝氮計算公式如下：

亞硝氮積累率=［NO2--N］/（［NO2--N］+［NO3--N］）

2、結果與討論

2.1 抗生素對短程硝化反硝化去除性能的影響

如圖1所示，在階段一（1-105d），經過20d的調試后，亞硝氮平均積累率為93.72%，說明反應器啟動成功。出水TN、COD、NH4+-N的均值分別為13.19mg/L、29.12mg/L、4.53mg/L，平均去除率分別為69.73%、89.67%和88.96%。第21-105天為穩(wěn)定運行階段，TN、COD、NH4+-N的平均去除率分別為66.31%、88.90%、90.35%，SBR反應器出水均可達到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準》（GB18918-2002）一級A標準。出水亞硝氮均值為6.61mg/L，亞硝氮積累率一直保持在較高水平（平均值為85.30%），表明在低氨氮濃度條件下，通過運行參數(shù)的合理控制，可以實現(xiàn)穩(wěn)定的短程硝化反硝化效果。

階段二（106-151d）投加100μg/LTC和SD后，系統(tǒng)出水TN、COD、NH4+-N的均值分別為8.30mg/L、23.08mg/L、2.41mg/L，平均去除率分別為73.72%、90.42%、92.48%；出水亞硝氮均值為3.98mg/L，亞硝氮仍保持較高的積累率，為82.61%。與階段一相比，添加抗生素對TN、COD、NH4+-N去除無明顯影響（圖1），這與前人的研究結果一致,如Zhang等研究表明,與未投加TC階段相比，投加100-500μg/L的TC后系統(tǒng)中的COD和NH4+-N去除效果無顯著變化。Collado等也發(fā)現(xiàn)50μg/L的SMX對SBR中有機物去除和脫氮效率幾乎無影響。有研究指出，未發(fā)現(xiàn)50μg/LTC顯著影響有機物的去除和硝化活性。此外，我們研究發(fā)現(xiàn)，100μg/LTC和SD選擇壓力對出水NO3--N的也幾乎無影響，其由階段一的1.54mg/L降低為階段二的1.24mg/L。在短程硝化反硝化系統(tǒng)中，雖然未發(fā)現(xiàn)100μg/LTC和SD暴露顯著影響污染物的去除，但抗生素暴露是否會影響微生物群落結構應進一步研究。

2.2 短程硝化反硝化中SOUR與EPS變化

如圖2所示，階段一（第61天、87天、105天）和階段二（第116天、126天、136天、151天）檢測到的短程硝化反硝化工藝中活性污泥的SOUR值（O2/MLSS）分別為7.6、7.0、10.7和12.5、12.3、12.3、11.6mgg-1h-1,平均SOUR分別為8.44和11.98mgg-1h-1，階段二中的SOUR較階段一提高了41.9%，說明100μg/LTC和SD增強了短程硝化反硝化系統(tǒng)中微生物的活性，這與Zhang等研究發(fā)現(xiàn)的TC暴露在μg/L水平可以增強好氧顆粒污泥微生物呼吸活性的結論一致。系統(tǒng)中的SOUR在第116天時達最大值12.5mgg-1h-1，隨后隨著抗生素暴露時間的延長而呈緩慢下降趨勢，到第151天時降至11.6mgg-1h-1，可能的原因是長時間運行使得污泥表面吸附大量抗生素，對微生物的活性產生了一定的抑制作用。

EPS在促進微生物聚集體形成、提升反應器污泥濃度、提高污染物去除效果、抵抗沖擊負荷以及在惡劣環(huán)境下保護微生物等方面發(fā)揮著重要作用，同時，EPS也是決定活性污泥理化性質和生物活性的關鍵組分。如圖3所示，在抗生素存在下，PN濃度從第105天的39.7mg/gMLSS逐漸增加到第116天的46.8mg/gMLSS；PS濃度從第105天的18.5mg/gMLSS逐漸增加到第116天的23.6mg/gMLSS。且在第15天時，PN濃度達最大值（63.5mg/gMLSS），PS則在第136天達最大值（32.8mg/gMLSS）。TC和SD的添加促進了微生物EPS的分泌，在細胞外形成網狀結構，從而保護自身免受抗生素的毒性作用。研究發(fā)現(xiàn)在SBR反應器中，PN和PS含量隨著土霉素投加濃度的增加而增加。在本研究中，蛋白含量明顯高于多糖含量，這與Zheng等的研究結果一致，可能是因為在抗生素存在條件下，微生物的蛋白質分泌代謝比多糖分泌代謝更敏感。

2.3 微生物群落變化

2.3.1微生物多樣性分析

如表2所示，第61天到第105天的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)呈上升趨勢。此外，通過比較Simpson和Shannon指數(shù)，發(fā)現(xiàn)第105天的多樣性高于第61天，說明在階段一，活性污泥中微生物群落豐富度和多樣性均隨著運行時間的增加而增加，且微生物多樣性在第105天時達到最大值。第105天、126天、151天樣品的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)呈下降趨勢，樣品的Shannon指數(shù)逐漸降低，Simpson指數(shù)逐漸增加，說明在100μg/LTC和SD選擇壓力下微生物的豐富度和多樣性均降低。

2.3.2 門水平微生物群落變化

圖4a顯示了在短程硝化反硝化系統(tǒng)活性污泥樣品中門水平上優(yōu)勢類群的分布，Patescibacteria、Actinobacteriota和Proteobacteria是所有活性污泥樣品中含量最豐富的3個門，通常在污水處理系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)，并且Proteobacteria是一類典型異養(yǎng)菌，通常存在于好氧生物處理系統(tǒng)中。第105天時，Patescibacteria、Actinobacteriota和Proteobacteria的相對豐度分別為37.11%、28.74%、15.56%。Patescibacteria在第61天的相對豐度為85.15%，但隨著運行時間的延長，第105天其相對豐度下降至37.11%。連續(xù)暴露于TC和SD導致活性污泥微生物群落顯示出明顯的變化，Patescibacteria的相對豐度降至27.49%，這表明它們可能容易受到抗生素的負面影響。Proteobacteria增加到18.26%，Actinobacteriota增加到35.23%，這與之前的研究結果類似，可能是抗生素暴露導致了一些對抗生素產生抗性的微生物增殖的結果。因此，抗生素選擇性壓力對短程硝化反硝化工藝活性污泥中抗生素抗性基因（ARGs）傳播的影響還需要進一步研究。

2.3.3 屬水平微生物群落變化

各階段反應器中的優(yōu)勢菌屬為TM7a和Tessaracoccus（圖4b）。TM7a的相對豐度從第105天的12.56%升高至第151天的14.0%，其相對豐度變化不大且有增加的趨勢，說明TM7a對100μg/L的TC和SD的脅迫具有較好的抗性。Tessaracoccus是一類兼性厭氧菌，存在于活性污泥、海底沉積物、被油污染的含鹽土中，對環(huán)境的適應能力較強。在本反應器中Tessaracoccus的相對豐度從第105天的5.38%增加第151天的14.76%，從而逐漸成為優(yōu)勢菌屬，這與李新慧等研究結果一致。

如表3所示，Nitrosomonas是短程硝化反硝化系統(tǒng)中豐度最高的AOB，抗生素脅迫對Nitrosomonas產生不利影響，其相對豐度從第105天的0.093%下降至第151天的0.062%。Ellin6067是該系統(tǒng)中的另一類AOB，在100μg/LTC和SD選擇壓力下，其相對豐度呈上升趨勢，說明該菌對抗生素脅迫具有較好的適應性。同時，反應器中仍存在一定豐度的NOB，且在整個運行過程中呈上升趨勢，但出水NO3--N略有降低（圖1B），說明在短程硝化反硝化工藝中，NOB并沒有被完全淘汰，只是其活性受到了一定的抑制作用。相比之下，Nitrosomonas較Ellin6067與Nitrotoga對TC和SD的脅迫沖擊更為敏感。總體而言，AOB的相對豐度在各階段污泥樣品中均較低（<0.12%），但氨氧化性能良好（NH4+-N去除率>90%）（圖1A），這與前人的研究結果一致。因此，今后的研究需要在脫氮功能基因水平上對AOB進行更深入的了解。

如圖4c所示，Rhodobacter和Thauera是反應器中相對豐度較高、典型的反硝化細菌。Thauera是一類硝酸鹽還原菌，具有代謝多種芳香族化合物的能力且常在污水處理系統(tǒng)中被檢出。而Rhodobacter是污水處理廠中一類潛在的反硝化細菌。在第105天，Thauera和Rhodobacter的相對豐度分別為0.32%、0.74%，第151天時兩者豐度分別上升至0.36%和4.8%，說明100μg/LTC和SD暴露對Thauera和Rhodobacter的生長具有促進作用。此外，皮爾森相關性分析結果表明，Rhodobacter與TN去除率顯著正相關（P<0.01），說明Rhodobacter對TN的去除發(fā)揮了重要作用。

3、結論

（1）100μg/L的TC與SD添加對短程硝化反硝化系統(tǒng)中NH4+-N和COD的去除幾乎無影響，出水TN、NH4+-N和COD等指標均可達排放標準；抗生素選擇壓力下，微生物EPS與SOUR值升高，從而提高了系統(tǒng)的抵御能力，維持了穩(wěn)定的脫氮性能。

（2）TC與SD脅迫下微生物多樣性與豐富度均降低，門水平上，Patescibacteria、Actinobacteriota和Proteobacteria是主導微生物；屬水平上，TM7a和Tessaracoccus是優(yōu)勢菌屬。在100μg/L的TC與SD選擇壓力下，TM7a和Tessaracoccus的相對豐度均呈上升趨勢。此外，TC與SD的存在促進了反硝化菌Thauera和Rhodobacter的富集，Rhodobacter可能對于TN的去除發(fā)揮了重要作用。

本研究考察了100μg/LTC和SD選擇性壓力下短程硝化反硝化工藝的脫氮性能及微生物群落結構響應規(guī)律，TC與SD持續(xù)暴露對短程硝化反硝化工藝去除性能幾乎無影響，系統(tǒng)中微生物群落發(fā)生了顯著變化以適應抗生素的選擇壓力。以上研究結果深化了我們對于抗生素脅迫下短程硝化反硝化工藝脫氮性能與微生物群落演替規(guī)律的認識，可為短程硝化反硝化工藝的實際應用提供理論基礎，但抗生素選擇性壓力對短程硝化反硝化工藝活性污泥中ARGs傳播的影響還需要進一步研究。（來源：中國科學院成都生物研究所，中國科學院環(huán)境與應用微生物重點實驗室，四川省環(huán)境微生物重點實驗室，中國科學院大學）